FLUOMAG

Sviluppo di un sistema innovativo per la diagnostica vegetale basato sulla separazione mediante nanoparticelle magnetiche fotoattive e rivelazione in fluorescenza.

Titolo progetto: Sviluppo di un sistema innovativo per la diagnostica vegetale basato sulla separazione mediante nanoparticelle magnetiche e rivelazione in fluorescenza
Acronimo: FLUOMAG
Coordinatore:: Giuseppe Caputo (Pianeta s.r.l.)

TP/LS di appartenenza: CMDI/NDHCA1
Soggetti coinvolti: Cori, Istituto Nazionale di Ricerca Metrologica, Istituto di Virologia Vegetale, Università di Torino (NIS)

Status: Concluso

Abstract: Il progetto FLUOMAG ha permesso la progettazione, lo studio e la realizzazione prototipale di un sistema diagnostico
molecolare innovativo basato sull’utilizzo di nanoparticelle magnetiche come fase solida di separazione, nuovi composti fluores
centi per la rilevazione del segnale e di sonde oligonucleotidiche appositamente studiate e generate mediante tecniche di clonaggio di patologie vegetali rappresentative quali la Flavescenza dorata della vite ed il Giallume di crisantemo. Il sistema diagnostico si è dimostrato industrializzabile e, in futuro, commerciabile.

Contatto per ulteriori informazioni:
Nome: Giuseppe Caputo
Organizzazione: Pianeta S.r.l.
Indirizzo: Via Giannone 3, 10036 Settimo Torinese (TO)
Telefono: 011.8028437
E-mail: giuseppe.caputo@pianeta.eu
Web: www.pianeta.eu

Il problema affrontato

Attualmente uno dei principali problemi della diagnostica vegetale è la disponibilità di metodologie che permettano la
diagnosi rapida e ripetibile della popolazione microbica interagente con la pianta, nonché la caratterizzazione in un solo
test dell’insieme di tali microrganismi. Questo è ancor più importante se si considera che, per numerose specie di
interesse agronomico, parecchi microrganismi patogeni e/o simbionti non sono isolabili con classici metodi di coltura.

Le particelle superparamagnetiche, con la possibilità di attivazione della loro superficie con diverse molecole (sonde ad
acido nucleico o anticorpi) e con la progettazione di composti fluorescenti specifici rappresentano una possibile soluzione ai problemi descritti. Esse sono già utilizzate con successo in campo medico dove sono già disponibili protocolli specifici per l’introduzione di gruppi reattivi sulla superficie che permettano il successivo legame covalente con le molecole attive, soprattutto anticorpi.

Recentemente sono anche stati sviluppati test rapidi mediante bio-barcode per il rilevamento specifico di DNA sintetico in formato multiplex. Queste procedure sono adattabili al rilevamento del DNA genomico dei microrganismi (patogeni e non) e, nel caso di microrganismi presenti in con centrazione molto scarsa, si può ipotizzare di utilizzare l’RNA messaggero di geni altamente espressi come bersaglio diagnostico.

Inoltre la produzione di queste particelle può essere effettuata all’interno di uno degli Istituti coinvolti nel presente progetto e non presenta particolari difficoltà. Attualmente i kit in commercio presentano una bassa attendibilità e un alto costo, oltre che caratteristiche non specifiche per l’utilizzo fitosanitario.

Le attività realizzate

l progetto di ricerca è stato suddiviso in cinque workpackages (WP) tecnici raggruppanti attività omogenee.

Nel WP1 “Identificazione e disegno dei reagenti diagnostici” si sono affrontate le problematiche nell’individuazione dei bersagli diagnostici (virus e fitoplasmi della vite), della definizione dei parametri di sintesi de i materiali utilizzati e delle specifiche del sistema diagnostico nel suo complesso.

Nel WP2 “Sviluppo e realizzazione delle nanoparticelle magnetiche” è stata eseguita la produzione di nanoparticelle (NP) magnetiche funzionalizzate mediante le seguenti fasi:

  1. sintesi  di  nanoparticelle  superparamagnetiche  di  ossido  di  ferro;
  2. ricoprimento delle particelle prodotte con uno strato silice amorfa;
  3. funzionalizzazione della superficie con gruppi amminici;
  4. attivazione con un reagente etero – bifunzionale (sulfo-SMCC);
  5. coniugazione delle particelle funzionalizzate con oligonucleotidi sonda capaci di riconoscere sequenze del materiale genetico del patogeno di interesse.

Nel WP3 “Progettazione e sintesi dei reagenti” sono state progettate e ottenute le sequenze degli oligonucleotidi che sono utilizzati nel saggio diagnostico.  Gli oligo ottenuti sono stati poi opportunamente funzionalizzati per permetterne il legame alle NP magnetiche (sonde di cattura) e ai composti fluorescenti che sono stati progettati e sintetizzati per la rilevazione del segnale di ibridazione fra la sonda di cattura e la sequenza bersaglio.

Nel WP4 “Ottimizzazione dei protocolli diagnostici” sono state realizzate molte preparazioni dei componenti in piccoli volumi, utilizzate subito dopo la preparazione per effettuare le prove di laboratorio (prove di funzionamento), indispensabili per arrivare alla miglior formulazione possibile del kit.

Infine nel WP5 “Realizzazione e test dei prototipi”, si è partiti dalla definizione dei parametri di confezionamento: materiali, volumi ecc.  tenendo presente le esigenze dei futuri utilizzatori dei kit: numero di test per confezione, modularità del prodotto (cioè quante sedute diverse di analisi possono essere effettuate con il volume di reagenti forniti), comodità e sicurezza di utilizzo, ecc. È stato identificato il panel di campioni di viti della cv Barbera infetti da flavescenza dorata e provenienti da un vigneto in produzione e sono stati anche completati i controlli diagnostici per i fitoplasmi. Con il supporto della documentazione tecnica sono stati preparati i kit prototipi, necessari per la convalida finale e per le prove di stabilità

I risultati raggiunti e sfruttamento dei risultati

Gli obiettivi del Progetto sono stati raggiunti. I templati per la diagnosi, il disegno delle sonde e la funzionalizzazione delle nano particelle magnetiche sono state effettuate con successo dimostrando che ilmetodo seguito è sufficientemente flessibile da poter essere adattato alla diagnosi di molecole di acido nucleico diverse, aprendo la strada ad ulteriori sviluppi nei settori della diagnosi e del rilevamento di analiti costituiti da catene di diversa lunghezza diacido ribonucleico e desossiribonucleico.

I tre dispositivi di cui si sono preparati i prototipi e si è fatta la convalida,hanno evidenziato prestazioni elevate che fanno pensare positivamente circa la possibilità di una loro affermazione sul mercato. I dati ottenuti con i due dispositivi di cui si è realizzato lo sviluppo, ma non la preparazione dei prototipi, autorizzano ottimismo circa le prestazioni che potranno fornire e che verranno verificate, con attività esterne al progetto, al momento del la disponibilità delle risorse necessarie. I dati fino ad ora raccolti relativamente al modello realizzato con la metodologia basata sull’immobilizzazione su nanoparticelle magnetiche di sonde nucleotidiche specifiche per i patogeni considerati, attraverso un processo di riconoscimento molecolare, separazione magnetica e rivelazione con marcatori oligonucleotidici fluorescenti, dimostrano la realizzabilità del dispositivo.

Il Progetto ha anche rafforzato il legame tra i diversi Partners che hanno collabora to attivamente al raggiungimento dei risultati.

I numeri del progetto

Altri Partner Privati: : Cori s.r.l.
Altri Partner pubblici: INRIM, CNR-IVV, Unito-NIS
N° totale partner: 5
N° ricercatori dipendenti (tempo determinato ed indeterminato e cocopro) coinvolti:
Durata in mesi: 36
Budget totale: 546.000 euro
Finanziamento: 273.000 euro
N° pubblicazioni scientifiche: 2
N° presentazioni a convegni e seminari: 4
N° brevetti depositati: 1
N° posti di lavoro a tempo indeterminato, determinato e cocopro creati: 3
N° posti di lavoro mantenuti a fine progetto: 1
N° ricercatori pubblici coinvolti: 12

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